Implementazione delle 3R

Nel 1959 due accademici britannici, William Russell e Rex Burch, membri della “University Federation of Animal Welfare”, un’associazione tuttora molto attiva nel campo del benessere animale, pubblicarono un libro destinato a diventare un caposaldo per l’evoluzione della sperimentazione animale: “The Principles of Humane Experimental Technique”. In questo loro volume i due studiosi presentavano un approccio alla ricerca sperimentale con uso di animali che tenesse presente sia la qualità del dato sia il benessere degli animali utilizzati. Questa “ricetta” è nota come principio, o modello, delle “3R”: Replacement, Reduction e Refinement.

La prima R imponde di chiedersi, preliminarmente, se sia possibile sostituire il modello animale prescelto con metodologie che permetto di raggiungere lo stesso risultato senza l’impiego di animali (Replacement, o Sostituzione), oppure utilizzando il modello animale “più semplice” (Sostituzione parziale).

Se ciò è impossibile, occorre utilizzare ogni mezzo per ridurre al minimo il numero di individui utilizzati, senza compromettere l’affidabilità del risultato (Reduction, Riduzione).

Infine, gli animali utilizzati – a qualunque specie appartengano – devono essere trattati con tutti i mezzi più idonei a rendere le procedure meno impattanti sul loro benessere, riducendo il più possibile qualsiasi tipo di sofferenza eventualmente derivante dalle procedure sperimentali o dalla condizione di stabulazione (Refinement, Affinamento).

Le “3Rs” si sono evolute nel tempo, anche se i principi di fondo sono rimasti sempre gli stessi e sono ora formalmente integrati nella legislazione europea e nazionale che tutela il benessere degli animali utilizzati per scopi scientifici.

Sostituzione
Dichiarazione che le specie animale di cui si farà uso sono quelle a più basso sviluppo neurologico, nonché della mancanza di metodi alternativi, compatibili con l’obiettivo del progetto di ricerca, D.lgs 26/2014, art. 13 comma 2

I progetti di ricerca di base in corso mirano a comprendere i meccanismi neuronali alla base di funzioni motorie e socio-cognitive di alto livello, espresse nel repertorio comportamentale di poche specie di primati oltre l’Uomo.

La prima e più ovvia opzione per sostituire il modello animale consisterebbe nello studiare le stesse funzioni direttamente su soggetti umani. Ciò è effettivamente possibile e largamente perseguito grazie a tecniche di indagine indirette e non invasive dell’attività cerebrale, come la risonanza magnetica funzionale (fMRI), l’elettroencefalogramma ad alta intensità (EEG), la stimolazione magnetica transcranica (TMS) e la magnetoencefalografia (MEG). Inoltre, negli ultimi 20 anni il ricorso a tecniche di monitoraggio elettroencefalografico intracranico prolungato per la valutazione pre-chirurgica della localizzazione di focolai epilettogeni in pazienti con epilessia farmacoresistente ed esami di risonanza magnetica negativi, ha consentito di articolare maggiormente lo studio delle funzioni cerebrali umane con tecniche invasive utilizzate a scopo primariamente clinico (vedi per esempio¹). I modelli di simulazione computazionale costituiscono un’ulteriore possibilità di integrazione dei dati acquisiti e di formulazione di ipotesi e previsioni empiricamente fondate, ma necessitano di dati sperimentali diretti. Questi approcci hanno contribuito ad una marcata riduzione dell’uso di animali – in particolare primati non umani – utilizzati per la ricerca neuroscientifica (da ~8.000 a ~6.000 in Europa tra il 2008 e il 2011, −25%, fonte: SCHEER report 2017). Tuttavia, nessuna di tali tecniche consente oggi di sostituire il modello animale per studi a livello di singolo neurone e di reti neuronali, che richiedono registrazioni elettrofisiologiche dirette.

Studi con registrazioni simultanee da più regioni sono essenziali per collegare il livello di singola cellula al macrosistema di reti neuronali, nonché per poter fare inferenze causali sui meccanismi che generano il comportamento. Questo paradigma, già largamente sviluppato nei modelli murini^2,3, non è trasferibile alle nostre domande di ricerca quando il repertorio motorio fine, la comunicazione e l’interazione sociale richiedono omologie anatomo-funzionali e comportamentali che solo i primati non umani offrono. In questo quadro, le scimmie del genere Macaca rappresentano la specie a più basso sviluppo neurologico utilizzabile per raggiungere gli obiettivi dei progetti.

Le scimmie del genere Macaca (fascicularis e mulatta) sono specie di riferimento in ambito biomedico e neuroscientifico⁴, con omologie anatomo-funzionali, cognitive e comportamentali necessarie e sufficienti per risultati rilevanti sul piano comparativo ed evolutivo⁵. Le abilità di movimento degli arti e l’uso fine delle mani per il raggiungimento e la manipolazione di oggetti, per esempio, si basano su meccanismi e substrati evolutivamente conservati⁶. I macachi presentano un ampio repertorio sociale e affiliativo, espresso tramite posture, gesti mimico-facciali, vocalizzazioni e loro combinazioni multisensoriali, non paragonabile a specie a minore sviluppo neurologico⁷.

Più specificatamente, la specie Macaca mulatta è ampiamente utilizzata negli studi di neurofisiologia comportamentale per l’eccellente adattabilità e tolleranza alle condizioni di stabulazione e di laboratorio, nel rispetto delle adeguate misure di arricchimento ambientale e alloggiamento sociale⁸. È inoltre la specie con cui il nostro gruppo ha la maggiore esperienza diretta: biologia ed etologia sono state approfondite in numerosi progetti di ricerca neurofisiologica presso l’Università di Parma, autorizzati dal Ministero della Salute, e consolidati tramite formazione specifica per gli addetti ai compiti e alle funzioni di cui all’art. 23, comma 2, D.Lgs 26/2014 (DM 5 agosto 2021, modulo specifico per primati non umani) e collaborazioni continuative con altri centri primatologici e gruppi di ricerca in Europa e nel mondo (vedi Collaborazioni).

Riduzione
Massima riduzione del numero di animali utilizzati, compatibile con gli obiettivi del progetto di ricerca, D.lgs 26/2014, art. 13 comma 2

Negli studi neuroscientifici su primati non umani si adottano prevalentemente disegni entro-soggetto: la numerosità campionaria è definita non dal numero di animali, ma dal numero di misurazioni indipendenti ottenute in modo attendibile e riproducibile sul singolo soggetto. Per affrontare la variabilità interindividuale e garantire solidità e riproducibilità del dato, la letteratura neurofisiologica richiede come standard la replica dell’effetto in un secondo animale, sebbene anche un congruo numero di registrazioni e osservazioni ottenute sul singolo soggetto sia sempre più considerato utile e rilevante⁹. Di conseguenza, il numero minimo di animali necessario e sufficiente per ciascun esperimento neurofisiologico è tipicamente pari a 2.

L’impiego di nuove tecnologie che permettono di utilizzare gli stessi animali in esperimenti diversi (ad es. iniezioni di sostanze farmacologicamente attive e studi neuroanatomici nello stesso soggetto) consente di aumentare la qualità e la completezza dei risultati e, al contempo, di ridurre il numero complessivo di animali necessari a parità di informazioni ottenute, senza incremento della “cumulative severity”, ovvero senza arrecare danni o causare sofferenze maggiori al singolo animale.

Affinamento
Ottimizzazione della metodica per ridurre la sofferenza imposta all’animale durante l’esecuzione delle procedure, D.lgs 26/2014, art. 13 comma 2

L’affinamento nella ricerca su primati non umani è al tempo stesso un obbligo etico e normativo e un mezzo essenziale per ottimizzare la collaborazione degli animali e massimizzare la qualità dei dati (vedi Refinement techniques in non-human primate neuroscientific research). Tutte le procedure – dalla stabulazione agli interventi chirurgici o sessioni sperimentali – sono impostate secondo i migliori standard internazionali. Il nostro sforzo per il superamento definitivo dei sistemi ferma-testa a favore di tecnologie wireless con animale libero rappresenta un salto di qualità che va oltre gli standard correnti e recepisce le raccomandazioni europee più recenti (cfr. SCHEER report 2017).

Gli animali provengono da fornitori europei autorizzati o, preferibilmente, centri di riproduzione europei in grado di garantire la disponibilità di animali cosiddetti di seconda generazione, o F2, il che implica che né animali ne genitori degli animali utilizzati vengono mai direttamente prelevati dallo stato selvatico.

Il trasporto è effettuato da personale formato e autorizzato, con mezzi idonei. Dall’acquisizione in poi, in ottica di miglioramento della “esperienza di vita cumulativa”, applichiamo misure di raffinamento che investono tutti gli aspetti gestionali, dalla stabulazione alle procedure sperimentali, come dettagliato nelle sezioni seguenti.

▪ Formazione di tutto il personale. La valutazione, monitoraggio, e ottimizzazione dell’ambiente e delle procedure durante l’intero ciclo di vita degli animali possono portare a sostanziali benefici soltanto nella misura in cui siano seguiti da personale esperto e adeguatamente formato allo scopo. Per questa ragione, tutto il personale con responsabilità dirette sulle procedure o sulla gestione quotidiana degli animali riceve un’adeguata formazione specifica di tipo teorico-pratico, dimostrata dal conseguimento della formazione per gli addetti ai compiti e alle funzioni di cui all’articolo 23, comma 2, del D.Lgs n.26/2014 (DM 5 agosto 2021) specifico per primati non umani utilizzati a scopo sperimentale prima di iniziare qualsiasi interazione con gli animali. Il continuo confronto con il personale (colleghi e veterinari) che opera in altri centri primatologici europei è frutto di aggiornamento e formazione continua che si aggiungono all’aggiornamento periodico dello staff ottenuto mediante la partecipazione a seminari ed eventi specifici in materia di 3R e benessere animale.

▪ Stabulazione e arricchimento ambientale. Il nostro stabulario adotta un sistema di gabbie comunicanti conforme alla Direttiva 2010/63/UE e al D.Lgs. 26/2014, progettato e realizzato da un’azienda leader nel settore in collaborazione con i principali centri primatologici europei. Gli animali (fino ad un massimo di 20) sono ospitati in coppia o in piccoli gruppi in spazi sempre superiori ai limiti di legge (≥ 2,5 m³ vs 1,8 m³ previsti per animale).

L’arricchimento ambientale segue un programma di rotazione quotidiana che include interventi di tipo fisico/strutturale (liane, giocattoli sospesi, elementi per arrampicata), sensoriale (specchi, stimoli visivi e/o sonori), alimentare (substrati di segatura o di corteccia naturale per la dispersione di semi e piccoli alimenti; oggetti traforati per il “foraging”), cognitivo-occupazionale (puzzle e attività di problem-solving), e sociale. Sono inoltre presenti gabbie di ricreazione con strutture in legno e altalene, accessibili a coppie o piccoli gruppi di animali secondo turnazione giornaliera, per consentire loro di mantenere attivo ed esercitare l’intero repertorio comportamentale specie-specifico (e.g. arrampicata, salto, esplorazione). All’interno dello stabulario è disponibile anche una stanza di stabulazione per gruppi di animali (L × P × H: 3.43 × 2.3 × 2.72 m), dotata di un’ampia struttura in legno per arrampicata e salto, pavimento in corteccia naturale e collegamento diretto ad altre gabbie tramite un tunnel sopraelevato.

Un sistema di diffusione sonora e monitor per video forniscono ulteriore arricchimento sensoriale e cognitivo.

L’ambiente beneficia di ampie finestre per un’ottimale illuminazione naturale e il mantenimento di cicli giorno/notte regolari; l’illuminazione artificiale è controllata da timer. Il clima è gestito da un sistema di controllo della temperatura con allarmi attivi 24/7.

La gestione igienico-sanitaria degli ambienti e la nutrizione quotidiana sono affidate a personale tecnico formato, che opera secondo le indicazioni e sotto la supervisione del personale ricercatore e del personale tecnico di assistenza alla ricerca.

▪ Addestramento mediante rinforzo positivo. Tutti gli animali sono addestrati esclusivamente con metodi basati sul rinforzo positivo e la cooperazione volontaria. Il percorso inizia con una fase di familiarizzazione progressiva con gli sperimentatori e con le attrezzature, durante la quale vengono impartiti semplici comandi attraverso la gabbia e rinforzati con piccole ricompense alimentari (ad es. frutta), distinte dalla razione secca giornaliera.

Le procedure di abituazione e di addestramento specifico sono eseguite da personale competente, mediante tecniche di condizionamento operante e rinforzo positivo¹⁰. Il clicker training viene impiegato in modo sistematico come segnale acustico immediato che marca il comportamento corretto e prelude alla ricompensa, facilitando e accelerando l’apprendimento^11,12.

Per le sessioni sperimentali, gli animali sono progressivamente addestrati ad avvicinarsi, entrare e rimanere nella sedia per primati per periodi inizialmente brevi e via via più estesi, senza utilizzo di collari o distanziatori rigidi^13,14. Le sessioni sono pianificate con obiettivi graduali, hanno durata contenuta e vengono interrotte o modulate in presenza di segnali di stress, a tutela del benessere animale e della qualità dei dati.

Nel nostro laboratorio stiamo adottando in modo sistematico procedure che eliminano i dispositivi di fissaggio della testa e che implementano l’utilizzo di trasportini in plexiglass trasparente per il trasferimento degli animali nell’ambiente attrezzato per le registrazioni wireless. Questo approccio consente percorsi di abituazione più brevi (in genere poche settimane) e con minimi segni di stress o rifiuto, rispetto ai protocolli tradizionali, che possono richiedere fino ad un anno, in particolare per la delicata fase di abituazione degli animali ad accettare, ripetutamente, la limitata mobilità sulla sedia per primati. La gradualità rimane un principio cardine: l’addestramento procede per step, riducendo così il rischio di regressioni e favorendo la cooperazione volontaria.

L’addestramento specifico ai compiti sperimentali, quando necessario, viene condotto con le stesse metodologie comportamentali evidence-based: analisi del compito, scomposizione del comportamento in componenti elementari, rinforzo differenziale dei comportamenti spontanei che si avvicinano al bersaglio, shaping della risposta e fade-out dei cue impiegati come step intermedi. L’obiettivo è selezionare e rinforzare i comportamenti più prossimi al comportamento desiderato, favorendo l’estinzione di quelli alternativi e portando all’acquisizione progressiva delle abilità richieste anche in compiti cognitivamente complessi. Questo percorso, del tutto in linea con le pratiche dei migliori addestratori cinofili, rappresenta un avanzamento all’interno del panorama delle 3R, coniugando benessere animale e qualità dei dati.

▪ Miniaturizzazione e raffinamento dei dispositivi invasivi. Tutti i dispositivi impiantati (come il sistema di interconnessione per i trasmettitori wireless) sono realizzati in materiali biocompatibili, con dimensioni ridotte al massimo. I probe multielettrodici impiegati hanno diametri tipicamente compresi fra 50–100 µm, così da limitare il danno tissutale a livelli trascurabili, come confermato da analisi istologiche in precedenti studi¹⁵.  Ciò consente anche il reinserimento degli animali a fine esperimento, senza necessità di ricorrere ad eutanasia a meno che sia richiesto dal protocollo sperimentale per consentire la ricostruzione dell’anatomia e delle connessioni delle regioni cerebrali studiate.

I dispositivi ferma-testa ancora in uso, impiegati solo dove necessario, si sono dimostrati particolarmente ben tollerati, mostrando un’eccellente osteo-integrazione evidenziata anche da esami post-mortem¹⁶. In linea con il principio di affinamento (3R), ci stiamo spostando stabilmente verso un sistema di immobilizzazione della testa non invasivo, completamente esterno e temporaneo, che non prevede alcun impianto fisso sul cranio. Questo supporto viene applicato solo per pochi istanti, esclusivamente per stabilizzare il capo mentre si collega il sistema di registrazione wireless, e poi rimosso. L’approccio riduce la manipolazione dell’animale, accorcia la preparazione pre-sessione, ed elimina il rischio di complicanze infettive o infiammatorie associate alla presenza di un impianto cronico.

In parallelo, adottiamo, quando possibile, registrazioni croniche o semi-croniche con impianti effettuati ad osso cranico integro nella regione di interesse (eseguito comunque in anestesia generale), minimizzando la manipolazione prima di ogni sessione e riducendo drasticamente i rischi di infezione o di infiammazione e quindi contribuendo ulteriormente a migliorare il benessere degli animali.

▪ Anestetici, tecniche chirurgiche e trattamento farmacologico post-operatorio. Tutte le procedure chirurgiche maggiori sono eseguite a in anestesia generale gassosa con alogenati somministrata e controllata da un veterinario con formazione specifica per gli addetti ai compiti e alle funzioni di cui all’art. 23, comma 2, D.Lgs 26/2014 (DM 5 agosto 2021, modulo specifico per primati non umani) ed esperienza nell’anestesia di primati non umani. 
Il monitoraggio intraoperatorio comprende temperatura, frequenza respiratoria, spirometria, saturazione di O₂, frequenza cardiaca, tracciato ECG e pressione arteriosa non invasiva ed è effettuato mediante monitor multiparametrico gestito dall’anestesista. Per la pianificazione pre-operatoria ed il targeting intra-operatorio, il laboratorio impiega un sistema di neuronavigazione che integra risonanza magnetica e TAC per creare modelli soggetto-specifici, supportare la definizione di traiettorie ottimali e l’esecuzione guidata delle procedure. Questo consente impianti mirati e accurati, contribuendo a ridurre tempi e manipolazioni e a migliorare la sicurezza e la ripetibilità degli impianti.

Il decorso post-operatorio è seguito dal personale responsabile della gestione dell’animale sotto la supervisione del Veterinario Designato e del veterinario anestesista, che prescrivono e modulano la terapia antibiotica, antinfiammatoria e analgesica fino a completo recupero.

Lo studio della morfologia cerebrale permette di identificare con precisione la regione di interesse ed è alla base dell’impiego di probe cronici o semi-cronici impiantati precisamente nella regione bersaglio.

La registrazione multicanale consente di acquisire l’attività da centinaia di siti simultaneamente, limitando così il danno tissutale e massimizzando la quantità e qualità dei dati.

Il monitoraggio dei parametri comportamentali, come la cinematica del movimento o la posizione oculare è effettuato con metodologie totalmente non invasive che garantiscono stabilità del segnale in ogni condizione di luce visibile.

Gli studi neuroanatomici non richiedono procedure aggiuntive rispetto a quelle già previste per quelli neurofisiologici e non necessitano di animali dedicati; di conseguenza non producono effetti additivi in termini di “cumulative severity”. Quando è scientificamente necessario ricostruire con precisione la rete anatomica del cervello studiato, si procede a eutanasia indolore, secondo le metodiche previste per la specie.

Quando invece tale verifica non è richiesta o non è parte scientificamente necessaria del piano sperimentale, gli impianti vengono rimossi chirurgicamente gli animali vengono inseriti all’interno di un programma di ricollocamento presso centri di recupero accreditati, in conformità alla normativa vigente e previa valutazione veterinaria (idoneità sanitaria, periodo di osservazione, requisiti comportamentali).

Per prevenire e gestire efficacemente possibili eventi avversi, adottiamo un monitoraggio costante del benessere, svolto da personale formato e qualificato. Per ciascun soggetto viene compilata, al momento dell’ingresso in stabulario, una scheda di valutazione clinica individuale, aggiornata quotidianamente per l’intero ciclo di vita. Il monitoraggio quotidiano registra informazioni più ampie rispetto a quanto richiesto dal personal history file previsto dalla normativa: osservazioni cliniche e comportamentali, quantità e tipologia di cibo e liquidi assunti, peso corporeo, eventi o comportamenti degni di nota, tipologia di arricchimento fornita e grado di interazione, performance durane il training ed eventuali compiti sperimentali.

Tutti gli animali coinvolti in una procedura, anche solo in fase di training, vengono osservati da - o interagiscono ogni giorno con - almeno uno sperimentatore e/o tecnico di riferimento, in grado di rilevare prontamente qualsiasi deviazione dallo stato ottimale e di attivare le opportune azioni correttive, quali valutazione veterinaria, modifica o pausa nel training, adattamento delle condizioni ambientali o dell’arricchimento. Le informazioni raccolte consentono di modulare e ottimizzare i protocolli in base alle caratteristiche individuali del singolo animale.